HITACHI CP80WX超速离心机用户操作分离叶绿体DNA实例

植物中叶绿体DNA与其他细胞DNA的分离涉及几个步骤，以确保分离的DNA主要来自叶绿体，叶绿体是植物细胞中的光合细胞器。以下是概述该过程的详细步骤：

所需材料：

• 新鲜植物组织（由于叶绿体浓度高，叶子常用）
• 均质化缓冲液（例如，含有50mM Tris-HCl、10mM EDTA和0.35 M山梨醇的缓冲液，pH 8.0）
• 细胞壁消化酶（如纤维素酶、果胶酶）
• 离心机和CP80WX超速离心机
• 蔗糖梯度（例如，15%、40%和85%蔗糖溶液）
• 用于DNA提取的裂解缓冲液（含有SDS等洗涤剂）
• 苯酚：氯仿：DNA纯化用异戊醇
• 用于DNA沉淀的乙醇
• TE缓冲液或无核酸酶的水用于DNA再悬浮

协议步骤：

1.组织均质化：

• 准备植物组织：收集新鲜叶子并清洗它们以去除任何表面污染物。
• 切碎叶子：将叶子切碎，以增加表面积，从而更有效地均匀化。
• 均质：使用搅拌机或研钵和杵将切碎的叶子在冷均质缓冲液中均质。保持混合物低温以尽量减少酶活性并防止DNA降解。

2、酶消化：

• 添加酶：在匀浆中加入纤维素酶和果胶酶等酶来消化细胞壁。这一步有助于从细胞中释放细胞器。
• 孵育：让混合物在37℃下温和摇晃孵育1-2小时。

3.叶绿体分离：

• 离心：以低速离心匀浆（例如，1,000×g 10分钟）以沉淀较大的碎片和未破碎的细胞。
• 收集上清液：上清液含有叶绿体。以更高的速度离心（例如，10,000×g 10分钟）以沉淀叶绿体。
• 蔗糖梯度离心：将叶绿体沉淀重悬在40%蔗糖的小体积中，并层到预先形成的蔗糖梯度上（顶部15%，底部85%）。以100,000×g超速离心1-2小时，以进一步纯化叶绿体。

4. DNA提取：

• 叶绿体的裂解：将叶绿体沉淀重悬在含有SDS的裂解缓冲液中以释放DNA。
• 苯酚：氯仿提取：向裂解物、涡旋和离心机中加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇以分离相。上层水相含有脱氧核糖核酸。
• DNA沉淀：将水相转移到新管中，加入2体积的冷乙醇沉淀DNA。混合均匀，在-20°C过夜或-80°C储存1小时。

5. DNA纯化：

• 离心：高速离心DNA样品（例如，12,000×g 10分钟）以沉淀DNA。
• 洗涤沉淀：用70%乙醇洗涤DNA沉淀以去除杂质。
• 重悬DNA：风干沉淀，并将其溶解在TE缓冲液或无核酸酶的水中。

6.质量和数量评估：

• 分光光度法：使用分光光度计评估DNA的纯度和浓度。
• 琼脂糖凝胶电泳：通过在琼脂糖凝胶上运行等分试样来检查DNA的完整性。

具体操作注意事项

在进行叶绿体DNA的分离时，一些额外的注意事项和提示可以帮助确保程序的成功和可重复性：

1.组织选择

• 使用年轻的组织：年轻、健康和绿色的叶子是首选，因为它们含有更多的叶绿体。避免老的或患病的叶子，它们可能有更少的叶绿体和更高水平的污染物。
• 样品数量：确保你有足够的植物材料开始，因为有些步骤可能会导致材料的损失。

2.缓冲组件

• 缓冲液新鲜度：准备均质和其他缓冲液在提取当天新鲜，或确保它们在使用前保存完好并冷却。
• pH值和渗透压：适当的缓冲和渗透压对于在提取过程中保持叶绿体完整性至关重要。可能需要根据植物种类进行调整。

3.酶消化

• 酶质量：使用高质量、新鲜的酶来消化细胞壁，因为它们的活性会显著影响分离叶绿体的产量和纯度。
• 优化：酶消化的条件（如持续时间和温度）可能需要根据使用的植物组织的特定类型进行优化。

4.离心

• 温度控制：在低温（4℃）下执行所有离心步骤，以防止叶绿体及其DNA的降解。
• 速度和时间：精确计算每个离心步骤的速度和持续时间。过度离心会导致叶绿体断裂，而under-centrifugation可能无法有效地将叶绿体与其他细胞成分分离。

5.叶绿体的处理

• 温和处理：叶绿体是脆弱的；因此，移液和其他处理应该温和地进行，以避免破坏它们，这可能导致DNA剪切。

6.避免污染

• 核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶污染：确保所有设备和解决方案都是无核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的，以防止核酸降解。
• 交叉污染：使用单独的移液器和吸头，或者在样品之间彻底清洁它们，以防止交叉污染。

7.质量控制

• 完整性检查：定期通过凝胶电泳检查叶绿体DNA的完整性，以监测提取过程中的剪切。
• 污染检查：如果叶绿体DNA的纯度对你的实验至关重要，测试核或线粒体DNA的污染。

8.储存

• 储存条件：将分离的脱氧核糖核酸短期储存在-20℃或长期储存在-80℃以保持稳定性。避免反复冻融循环，这可能会损坏脱氧核糖核酸。

9.道德和法律考虑

• 许可证和法规：确保遵守关于收集和使用生物材料的当地和国际法规，特别是在处理濒危或受保护植物物种时。

这些附加注释有助于完善程序，使其适应特定需求，并确保避免叶绿体DNA分离中的常见陷阱。

该方案提供了分离叶绿体DNA的全面方法，这对于与植物遗传学，进化和生物技术相关的研究至关重要。纯化的叶绿体DNA可用于各种分子生物学应用，包括克隆，测序和PCR分析。