用日立超速离心机的5ml管从水稻叶片中提取基因组DNA

使用5毫升管子从水稻叶片样品中提取基因组DNA涉及几个关键步骤，确保您有效分离适合各种分子应用的高质量DNA。这个过程很简单，但需要小心处理，以防止DNA的污染和降解。以下是如何进行这种提取的详细指南：

所需材料：

• 新鲜或冷冻稻叶
• 5ml离心管
• 液氮（如果使用冷冻叶子）
• 砂浆和杵
• DNA提取缓冲液（2%CTAB，100mM Tris-HCl pH 8.0,20mM EDTA，1.4 MNaCl和可选的0.2%β-巯基乙醇）
• 氯仿：异戊醇（24:1）
• 异丙醇
• 70%乙醇
• TE缓冲液或无核酸酶水
• 水浴或培养箱在65°C
• 微量离心机
• 移液器和无菌吸头

协议步骤：

1.样品制备

• 收集新鲜叶子：选择年轻健康的水稻叶子以获得最佳效果。
• 冷冻和研磨叶子：如果不立即处理，将叶子冷冻在液氮中，并使用研钵和杵研磨成细粉。这一步有助于打破细胞壁并促进DNA的释放。

2.细胞裂解

• 准备裂解缓冲液：确保您的提取缓冲液在65°C。
• 向叶粉中加入缓冲液：将研磨的叶粉放入5ml管中，加入约3ml热提取缓冲液。
• 孵育混合物：通过涡旋彻底混合，然后在65℃孵育管至少30分钟，偶尔反转管以混合。

3.相分离

• 加入氯仿：异戊醇：向裂解物中加入等体积的氯仿：异戊醇，以帮助分离水相和有机相。通过将管子反转几次来混合均匀。
• 离心：在室温下以12,000g离心混合物10分钟以分离相。

4. DNA沉淀

• 转移水相：小心地将含有DNA的上层水相转移到新的管中，避免中间相和有机层。
• 沉淀脱氧核糖核酸：加入等体积的冷异丙醇沉淀脱氧核糖核酸。倒置管几次，让它在室温下静置10分钟或在冰箱里静置20分钟以提高产量。
• 离心：在4℃下以12,000g离心10分钟。应形成白色DNA沉淀。

5.洗涤和干燥

• 去除上清液：小心倾析上清液，而不干扰DNA沉淀。
• 洗涤DNA沉淀：向沉淀中加入1ml 70%乙醇，倒置管几次，并在12,000g离心5分钟。如果需要，重复洗涤步骤。
• 干燥颗粒：倒出乙醇，风干颗粒以去除任何剩余的乙醇。避免过度干燥，这会使脱氧核糖核酸难以重新悬浮。

6.再悬浮

• 重悬DNA：根据下游应用，将干燥的DNA沉淀溶解在小体积的TE缓冲液或无核酸酶的水中。

7.储存

• 储存DNA：将重悬浮的DNA储存在-20℃下长期储存。

8.核查

• 检查质量和数量：使用分光光度计或琼脂糖凝胶电泳来评估提取的DNA的质量和数量。

为了确保使用所述方法从水稻叶片中提取基因组DNA时获得最佳结果，请考虑以下额外的情况和最佳实践：

1.处理和样品选择：

• 使用年轻健康的组织：年轻的叶子通常含有较少的次生代谢产物含量，这会干扰DNA提取和质量。
• 避免污染或患病组织：患病组织中的污染物和降解产物可以抑制下游过程，如PCR。

2.缓冲液的制备和使用：

• 新鲜缓冲液：准备新鲜裂解缓冲液或储存在-20℃长期储存。使用前确保缓冲液完全解冻和混合。
• β-巯基乙醇注意：如果使用β-巯基乙醇，请在通风柜中工作，小心处理，因为它有毒，有强烈的气味。

3、研磨组织：

• 液氮研磨：通过保护核酸免受酶降解，确保细胞壁彻底破碎，提高产量和纯度。
• 均匀的颗粒尺寸：在研磨过程中实现精细均匀的颗粒尺寸，确保更有效的裂解和提取。

4.离心：

• 温度控制：如果可能，在低温（4℃）下进行离心，这有助于稳定DNA并防止降解。
• 小心相转移：添加氯仿：异戊醇后转移水相时，避免干扰相间。有机层的污染会影响DNA的纯度。

5. DNA沉淀：

• 完全沉淀：在离心前确保DNA已经完全沉淀。不完全沉淀会导致较低的产量。
• 冷异丙醇：使用冷异丙醇可以提高DNA沉淀效率。

6.颗粒洗涤：

• 彻底洗涤：用70%乙醇彻底洗涤DNA沉淀以去除可能干扰下游应用的盐和其他杂质是很重要的。
• 小心倾析：在洗涤步骤中去除乙醇时要小心，以避免丢失沉淀。

7. DNA再悬浮：

• 避免过度干燥：过度干燥的脱氧核糖核酸很难重新悬浮。目标是空气干燥，直到乙醇蒸发，但沉淀仍然稍微潮湿。
• 温和再悬浮：使用移液器轻轻地上下移液以重新悬浮DNA，而不是剧烈涡旋，以避免剪切。

8.质量控制：

• 纯度检查：使用分光光度计评估A260/A280的比率。比率在1.8和2.0之间通常表明DNA纯度良好。
• 完整性检查：在琼脂糖凝胶上运行DNA的等分试样来检查降解。完整的基因组DNA应该显示为高分子量带，没有明显的涂抹。

9.贮存：

• 长期储存：对于长期储存，建议将DNA保持在-20°C或-80°C。避免反复冻融循环，这会降解DNA。

通过遵守这些额外的指南和最佳实践，您可以最大限度地成功从水稻叶片中提取基因组DNA，确保高质量和数量适合您的研究需求。

该方案提供了一种可靠的方法，用于在5ml管中从水稻叶片中提取基因组DNA，确保良好的产量和纯度，适用于PCR，基因分型和其他分子生物学应用。