使用HITACHI超速离心机应用实例-分离G蛋白偶联受体

使用hitachi CP90WX超速离心机分离G蛋白偶联受体（GPCR）是一个详细的过程，由于GPCR等膜蛋白的敏感性和复杂性，需要仔细处理和准备。以下是如何进行这一过程的细分，包括膜级分的制备和随后的超速离心步骤：

所需材料：

• 高表达靶GPCR的细胞培养
• 均质化缓冲液（例如，含有10mM Tris-HCl，pH 7.4,1mM EDTA）
• 蛋白酶抑制剂
• 增溶洗涤剂（如Triton X-100、DDM）
• 超速离心机和超速离心机管
• 密度梯度培养基（例如，蔗糖、OptiPrep）
• 标准实验室设备（如移液管、涡流管等）

协议步骤：

1.细胞培养和收获：

• 培养细胞：生长已知表达靶GPCR的细胞，直到它们达到所需的汇合。
• 收获和洗涤细胞：通过离心收集细胞，并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤以去除培养基和血清成分。

2、膜制备：

• 均质化：将细胞重悬在含有蛋白酶抑制剂的均质化缓冲液中，以保护GPCR免受降解。使用杜斯匀浆器或超声波仪将细胞均质化以打开，但不过度剪切DNA。
• 离心：以低速（例如，1,000xg，10分钟）离心匀浆，以除去细胞核和未破碎的细胞。
• 收集膜级分：以更高的速度（例如，100,000×g，1小时）超速离心上清液以沉淀含有GPCR的膜级分。

3、膜的溶解：

• 重悬膜沉淀：将沉淀轻轻重悬在含有合适洗涤剂（如Triton X-100或DDM）的缓冲液中以溶解膜。这一步对于将GPCR释放到溶液中至关重要。
• 孵育：让混合物在冰上孵育1-2小时，偶尔混合以确保完全溶解。

4、超速离心提纯：

• 密度梯度设置：在超速离心管中准备密度梯度（使用蔗糖或OptiPrep）。小心地将溶解的膜溶液分层在梯度上。
• 超速离心：以非常高速（例如，200,000×g）离心数小时。GPCR将以其特征密度带状。

5.分数收集和分析：

• 收集级分：离心后，从梯度上仔细收集级分。含有GPCR的级分通常可以通过其密度来鉴定。
• 蛋白质分析：使用SDS-PAGE分析组分，然后进行蛋白质印迹检测GPCR。这证实了受体的存在并评估其纯度。

6.功能测试：

• 受体活性：使用配体结合测定或G蛋白偶联测定评估分离的GPCR的功能，以确保受体在分离后保持其活性。

其他考虑因素：

• 蛋白酶抑制剂：确保均质化和增溶缓冲液含有广谱蛋白酶抑制剂混合物，以防止GPCR降解。
• 洗涤剂的选择：洗涤剂的选择至关重要，应该根据特定的GPCR进行优化，因为一些洗涤剂可以变性或灭活受体。
• 温度控制：保持所有步骤低温（4℃），以防止GPCR降解。

具体操作注意事项

当使用超速离心分离G蛋白偶联受体（GPCR）时，一些额外的注意事项和提示可以帮助确保程序有效并产生高质量的结果：

1、洗涤剂使用优化：

• 洗涤剂选择：不同的GPCR在不同的洗涤剂中可能具有不同的稳定性。选择一种保持您正在研究的特定GPCR的结构和功能完整性的洗涤剂是至关重要的。常见的选择包括非离子洗涤剂，如十二烷基β-maltoside（DDM）和Triton X-100。
• 洗涤剂浓度：太少的洗涤剂可能无法完全溶解膜，而太多的洗涤剂会使蛋白质变性。找到正确的平衡至关重要。

2.蛋白酶抑制剂：

• 全面保护：使用的蛋白酶抑制剂混合物应该是广谱的，以涵盖一系列蛋白酶活性。鉴于GPCR对蛋白水解降解的敏感性，这一点尤为重要。

3、密度梯度介质：

• 梯度的选择：蔗糖梯度很常见，但像OptiPrep这样的梯度可以提供粘性较低的替代方案，这可能有助于在超速离心期间保持GPCR的功能和结构。
• 梯度形成：必须注意确保梯度正确平滑地形成，以避免可能破坏分离效率的混合。

4.样品处理：

• 温和再悬浮：当重新悬浮膜沉淀和处理溶解的GPCR时，温和的移液或反转对于防止可能损害受体的剪切应力至关重要。
• 温度保持：所有步骤应在4℃或冰上进行，样品应始终保持低温，以防止降解。

5.超速离心：

• 转子和速度：确保CP90WX超速离心机的转子和速度设置适合所使用的密度介质和体积，不正确的设置会导致分离不充分或样品损坏。
• 平衡管：始终小心平衡超速离心管，以避免损坏离心机，并确保均匀分离。

6.Post-Ultracentrifugation处理：

• 分数回收：当回收分数时，快速工作并保持样品冷，以防止GPCR活性的任何损失。
• 立即分析：收集后尽快分析级分。如果不能立即分析，级分应储存在-80℃以防止降解。

7.功能验证：

• 活性测定：纯化后功能测定对于确认GPCR在分离过程后保留其配体结合和信号转导能力至关重要。

8.污染和交联：

• 避免污染物：警惕试剂和实验室器皿中可能影响GPCR活性的污染物。
• 交联剂：如果需要稳定受体，考虑使用能够帮助在纯化过程中和纯化过程后保持其构象的交联剂。

9.文件：

• 详细记录：保留所有实验条件和结果的详细记录。这个留档对于故障排除、重复成功的实验或在未来的试验中进行必要的调整是无价的。

通过考虑这些额外的方面，您可以显著提高使用CP90WX超速离心的GPCR纯化工作的质量和可重复性。

这种使用超速离心分离GPCR的方法对于获得这些受体的高度纯制剂是强大的，但它需要仔细优化每个步骤以确保蛋白质的稳定性和功能。